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发布时间：2022-04-15 04:29:00 作者：立博泰业
RPA技术的基本原理
RPA技术主要依赖于三种酶：能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶。这三种酶的混合物在常温下也有活性，反应温度在37°C左右。
重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物，能在双链DNA中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。被替换的DNA链与SSB结合，防止进一步替换。在这个体系中，由两个相对的引物起始一个合成事件。整个过程进行得非常快，一般可在十分钟之内获得可检出水平的扩增产物。RPA扩增的基础体系(TwistAmp? Basic)含有DNA扩增所需的所有试剂，我们只要准备好引物和模板就行。扩增结果可以通过凝胶电泳进行终点检测，产物纯化后可用于下游研究。
在这个基础体系中添入不同的酶和探针，就可以实现多样化的RPA应用。举例来说，TwistAmp? exo结合了的exo探针技术和核酸外切酶III，能实现数据的实时读取，就像荧光定量PCR一样。不过反应终点的扩增子总量有所减少，适合获得强荧光信号进行动力学分析，不适合终点检测(比如跑胶)。将exo探针技术、核酸外切酶III和逆转录酶结合起来，可以一步实现RNA模板的实时扩增。
如何提高扩增曲线的可重复性?
A 优化扩增曲线考虑以下因素: 对于低拷贝数模板，不稳定扩增可能是因为达到检测限或者是反应混匀程度不同（未混匀的反应扩增效率不佳）。另外，在低温情况下存贮，重组酶和辅助蛋白在50%甘油情况下形成沉淀,也是可能导致不稳定扩增的原因。所以，20x***反应mix在室温下解冻并震荡涡旋将使其成为液体，不影响其功能,并且有效提高扩增效率。不稳定扩增也可能是因为master mix量不足，在加入体系前，用户必须保证震荡后20x***反应组分均一。
TwistDx试剂盒
等温核酸扩增的新进展为人工核酸提供了简化的孵育条件，只需要恒温而不是热循环。单一温度培养降低了设备要求，开辟了突破实验室界限并在资源匮乏环境中进行扩增的新途径。通过减少扩增时间，消除重复的加热和冷却步骤还为低资源实施提供了第二个优势。更快的反应发生不仅因为加热和冷却时间的减少，而且因为多个分子反应可以异步进行，而不是在人工加热和冷却循环中顺序操作。自 1990 年代初以来，大量的等温核酸扩增方法采用了各种反应机制。
自 1990 年代初以来，大量的等温核酸扩增方法采用了各种反应机制。成熟的方法是基于核酸序列的扩增（NASBA，也称为转录介导的扩增，TMA）、核糖核酸（RNA）技术的信号介导扩增（SMART）、解旋酶依赖性扩增（HDA） 、重组酶聚合酶扩增（RPA）、滚环扩增（RCA）、多重置换扩增（MDA）、环介导等温扩增（LAMP）和链置换扩增（SDA）；
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