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发布时间:2022-04-19 04:33:00 作者:立博泰业
RPA技术的基本原理
RPA技术主要依赖于三种酶:能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶。这三种酶的混合物在常温下也有活性,反应温度在37°C左右。
重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物,能在双链DNA中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列,就会发生链交换反应形成并启动DNA合成,对模板上的目标区域进行指数式扩增。被替换的DNA链与SSB结合,防止进一步替换。在这个体系中,由两个相对的引物起始一个合成事件。整个过程进行得非常快,一般可在十分钟之内获得可检出水平的扩增产物。RPA扩增的基础体系(TwistAmp? Basic)含有DNA扩增所需的所有试剂,我们只要准备好引物和模板就行。扩增结果可以通过凝胶电泳进行终点检测,产物纯化后可用于下游研究。
在这个基础体系中添入不同的酶和探针,就可以实现多样化的RPA应用。举例来说,TwistAmp? exo结合了的exo探针技术和核酸外切酶III,能实现数据的实时读取,就像荧光定量PCR一样。不过反应终点的扩增子总量有所减少,适合获得强荧光信号进行动力学分析,不适合终点检测(比如跑胶)。将exo探针技术、核酸外切酶III和逆转录酶结合起来,可以一步实现RNA模板的实时扩增。
TwistDx
TwistDx Inc. 由分子生物学家兼蛋白生物化学家 Niall Armes 博士以及 Derek Stemple 博士和 Nagesh Mahanthappa 博士于 1999 年共同创立,其总部位于英国马萨诸塞州剑桥市。TwistDx Limited 于 2002 年成立,其运营设施位于英国剑桥。
我们的愿景:TwistDx 希望将 RPA 分子检验和技术普及到所有可应用领域,使科学家和技术开发人员不再受到高温 DNA 扩增技术的束缚。
TwistDx试剂盒
DNA检测的原理是聚合酶链式反应(PCR)。如果你了病毒,那么应该能检测到病毒的核酸,我们可以利用体外DNA扩增的方式扩增这些核酸并检测。PCR就是一种体外DNA扩增的技术,简单来说就是可以让特定的DNA分子一条链变两条链,两条变四条,四条变八条,每个循环翻一倍。然后通过看经过多少个循环这个DNA分子的数量超过阈值,就可以计算原本样品中DNA的量(也就是说每少一个循环超过阈值说明病毒核酸的量多一倍)。一个30循环的PCR反应大概需要两小时。算上样品处理等时间应该会在四到五个小时左右,如果要等其他人一起做则更久。
RPA 于 2006 年由 ASM Scientific Ltd(英国剑桥,由 Wellcome Trust Sanger Institute 创立)的 Niall Armes 推出。虽然RPA在等温核酸扩增技术中还没有占据很大的市场份额(根据Grand View Research报告的数据,图1A),但它正在经历着快速的发展。迄今为止,已经发表了 250 多篇有关 RPA 的出版物,并且在过去六年中 RPA 的文献数量一直在增加;值得注意的是,RPA 文献数量从 2014 年开始呈指数增长。
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